目前已有6種基于嵌合抗原受體（CAR）修飾的免疫細胞的過繼細胞療法（ACT）被批準(zhǔn)用于治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤。與CAR-T細胞相比，CAR-NK細胞因其多種殺傷機制、更高的安全性和更廣泛的來源而受到越來越多的關(guān)注。誘導(dǎo)多能干細胞（iPSC）來源的NK（iPSC-NK）細胞具有成熟的表型和強大的細胞溶解活性，可以提供一個同質(zhì)的CAR-NK細胞群體，并擴展到臨床規(guī)模。因此，iPSC衍生的CAR-NK（CAR-iNK）細胞可以作為癌癥免疫治療的標(biāo)準(zhǔn)化和“通用型”產(chǎn)品。

NK細胞主要有四種來源：外周血、臍帶血、永生化細胞系（如NK-92）和誘導(dǎo)多能干細胞（iPSC）來源的NK細胞，其中外周血來源又可以分為自體來源和供體來源。下表總結(jié)了不同來源的NK細胞在免疫治療中的優(yōu)缺點。

表1 不同來源NK細胞在免疫治療領(lǐng)域的優(yōu)缺點

細胞來源	優(yōu)點	缺點
供體外周血	細胞成熟無需分化，已證明有臨床療效	分離困難，產(chǎn)量低
自體外周血	無同種異體反應(yīng)	依賴患者免疫細胞質(zhì)量，擴增困難，滯后時間長
臍帶血來源CD34+細胞	可大量體外分化	未成熟，細胞殺傷毒性小
NK-92細胞系	均一細胞群，無限擴增	不表達CD16，缺乏ADCC功能，安全性未知，輻照后效果減弱
iPSC	容易獲得，克隆生長、高擴增及體外分化	安全性未知

目前尚不完全清楚iPSC-NK細胞是否需要相同的激活途徑來誘導(dǎo)脫顆粒和細胞因子分泌。盡管如此，大量數(shù)據(jù)證實了iPSC-NK 結(jié)合了原代 NK 細胞和 NK-92 細胞系最具吸引力的優(yōu)勢，即：高潛在的細胞毒性（包括 ADCC 功能）和即使冷凍保存后也能在體內(nèi)擴增和持久存在的能力。

iPSC-NK培養(yǎng)方案

iPSC-NK細胞分化方案可以分為2D培養(yǎng)和3D培養(yǎng)兩種，兩種方式都需要通過誘導(dǎo)造血祖細胞（HPC）后獲得NK細胞。

01    iPSC-NK 2D培養(yǎng)

在最早的一種方案中，Kauffman團隊使用兩步體外2D分化方案，將人PSCs與小鼠骨髓基質(zhì)細胞共培養(yǎng)以促進造血分化，然后將分選的HPCs與第二步的基質(zhì)細胞系和包括IL-15、IL-3、IL-7、SCF和Flt3L的細胞因子混合物共培養(yǎng)以產(chǎn)生PSC衍生的NK細胞。其他組已經(jīng)用表達Notch配體DLL1或DLL4的基因工程飼養(yǎng)細胞取代了第二步的基質(zhì)細胞系，這些工程改造的細胞可以促進HPCs向NK譜系的分化和擴增

在2D培養(yǎng)方案中，飼養(yǎng)層體系因其高分化效率在基礎(chǔ)研究中應(yīng)用廣泛。飼養(yǎng)層細胞能分泌生長因子和細胞因子，促進干細胞特定方向分化，為研究者提供豐富的細胞資源。然而，其在臨床應(yīng)用中因安全性問題受限，如可能攜帶病原體、引發(fā)免疫排斥等，因此，臨床研究者們更傾向于采用更為安全、可控的培養(yǎng)方案。

在非飼養(yǎng)體系中，干細胞的增殖和分化高度依賴于外源添加的細胞因子，通過在培養(yǎng)基中添加BMP4，VEGF，F(xiàn)GFb，TPO，IL-11，IGF-1，SHH，Transferrin等細胞因子，促使iPSC分化成為造血干細胞。然后添加IL-15，IL-3，IL-7，SCF，F(xiàn)lt-3L等多種細胞因子誘導(dǎo)其分化生成NK細胞。

02    iPSC-NK 3D培養(yǎng)

在3D培養(yǎng)方案中，iPSC在沒有飼養(yǎng)層（低吸附板）的懸浮液中培養(yǎng)時，它們會自發(fā)地形成擬胚體（EB），EB中的細胞響應(yīng)外源性細胞因子信號，生長和分化為特定的細胞譜系，在DLL4蛋白包被的板子和包含細胞因子的分化培養(yǎng)基中最終得到NK細胞。

                  iPSC分化為NK細胞的3D方案示意圖

通過無飼養(yǎng)層體系胚狀體形成方法將iPSC分化為NK細胞，簡單的培養(yǎng)過程如下：未分化的iPSC細胞克隆使用TrypLE select處理后轉(zhuǎn)移至低吸附板，并在含有10μmol/L Y‐27632的iPSC培養(yǎng)基中孵育過夜，以形成胚狀體（EB）。收集EB并將其轉(zhuǎn)移到EB培養(yǎng)基中，并在40 ng/mL BMP‐4、10 ng/mL bFGF和50 ng/mL VEGF的存在下培養(yǎng)。第4天，EB與細胞因子混合物（50 ng/mL SCF、20 ng/mL Flt3L、20 ng/mL IL‐3和30 ng/mL TPO）一起培養(yǎng)。在培養(yǎng)的第14天，將分化的細胞轉(zhuǎn)移到FcDLL4包被的培養(yǎng)板上，并在細胞因子混合物（10 ng/mL Flt3L，5 ng/mL IL-7）的存在下培養(yǎng)。培養(yǎng)21天后，造血細胞分化為CD7+、CD45+淋巴細胞祖細胞（iLPC）。采集iLPC并用PHA刺激其擴增以產(chǎn)生iNK^[5]（圖3）。

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