免疫印跡實(shí)驗(yàn)流程

A. 溶液和試劑

注：利用反滲透去離子水 (RODI) 或同等級(jí)別的水制備溶液。

1. 1X 磷酸鹽緩沖液 (PBS)

2. 1X Tris 鹽緩沖液 (TBS)

3. 4X SDS 樣品緩沖液

4. 1X Tris-Glycine SDS 電泳緩沖液

5. 1X Tris-Glycine 轉(zhuǎn)移緩沖液脫脂奶粉

6. 封閉緩沖液：含 5% w/v 脫脂奶粉的 1X TBST

7. 洗滌緩沖液：1X TBST。

8. 一抗稀釋緩沖液： 5% 脫脂奶粉的 1X TBST

9. Prestained Protein Marker, Broad Range (10-180 kDa)(30-300 kDa)

10.印跡膜和紙

11.HRP 偶聯(lián)二抗

12.檢測(cè)試劑：ECL 化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒

 

B. 蛋白質(zhì)印跡制備樣品的常規(guī)流程。

樣品制備、SDS-PAGE 和轉(zhuǎn)移

1. 收集細(xì)胞，3000 轉(zhuǎn)/分鐘，離心 5 分鐘，棄上清。用 1X PBS 洗滌細(xì)胞一次。

2. 加入冰預(yù)冷的裂解液,放入冰水混合物的燒杯中 1.2"/5"×5 次超聲。

3. 加入 4X SDS 樣品緩沖液，在沸水中煮 5 分鐘，放在冰上冷卻。

4. 上樣 30 μg 到 SDS-PAGE 凝膠上。

5. 電轉(zhuǎn)移至 PVDF 膜上 。

 

C. 膜封閉和抗體孵育封閉和抗體孵育

I. 膜封閉轉(zhuǎn)移之后，將膜置于 25 mL 封閉緩沖液中，在室溫下孵育 2 小時(shí)。

II. 一抗、二抗孵育

1. 將膜和一抗（按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)中建議的適當(dāng)稀釋度和稀釋液）置于 6 mL 一抗稀釋緩沖液中在 4°C 下孵育過(guò)夜并不時(shí)輕輕晃動(dòng)。

2. 用 TBST 洗滌三次，每次 5 分鐘。

3. 按一抗來(lái)源選取合適的 HRP 偶聯(lián)的二抗，置于 6 mL 封閉緩沖液中在搖床上孵育2 小時(shí)。

4. 用 TBST 洗滌三次，每次 5 分鐘。

5. 繼續(xù)進(jìn)行檢測(cè)（D 部分）。

D. 蛋白質(zhì)檢測(cè)

將洗滌后的膜放置在 Fluor Chem E 顯色板上，將混合好的 A,B 液均勻的涂抹于膜上,將顯色板放入儀器中曝光，讀取數(shù)據(jù)。