當(dāng)?shù)孜锇l(fā)生化學(xué)反應(yīng)而產(chǎn)生的能量以光的形式釋放出來(lái)的時(shí)候,我們稱這個(gè)過(guò)程為化學(xué)發(fā)光。魯米諾(luminol)是最常用的化學(xué)發(fā)光試劑之
一,被過(guò)氧化物氧化后它會(huì)產(chǎn)生一種激發(fā)態(tài)的產(chǎn)物——aminophthalate。這種產(chǎn)物衰變至低能態(tài)的同時(shí)釋放出光子。專利添加物可以提高魯米諾反
應(yīng)的發(fā)光強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間以及靈敏度。
化學(xué)發(fā)光底物被廣泛使用是因?yàn)槠渚哂衅渌麢z測(cè)方法不具備的優(yōu)點(diǎn),這些優(yōu)點(diǎn)使得化學(xué)發(fā)光成為大多數(shù)蛋白實(shí)驗(yàn)室首選的檢測(cè)方法。使用化
學(xué)發(fā)光可以通過(guò)多次曝光獲得最好的成像結(jié)果。還可以將檢測(cè)試劑完全去除,再對(duì)其他目的蛋白進(jìn)行檢測(cè)并成像,或?qū)z測(cè)條件進(jìn)行優(yōu)化。具有很
寬的線性響應(yīng)范圍,從而可以檢測(cè)并定量很寬濃度范圍的蛋白質(zhì)。最重要的是,化學(xué)發(fā)光在所有的檢測(cè)方法中具有最高的靈敏度。使用辣根過(guò)氧化
物酶標(biāo)記的抗體和G-Biosciences公司的femtoLUCENT? PLUS (貨號(hào) # 786-003),可以檢測(cè)的下限為飛克級(jí),而這得益于這種底物中的增強(qiáng)劑
可以很大程度地增強(qiáng)發(fā)光強(qiáng)度并提高靈敏度。
化學(xué)發(fā)光底物與其他底物不同之處在于只有在酶和底物發(fā)生反應(yīng)的時(shí)候才會(huì)產(chǎn)生瞬時(shí)的可被檢測(cè)的光。這與那些可產(chǎn)生穩(wěn)定有顏色產(chǎn)物的底
物不同;些有顏色的沉淀在酶-底物反應(yīng)結(jié)束之后仍然存在于膜上。在化學(xué)發(fā)光免疫印跡中,底物是反應(yīng)限制試劑。一旦其耗盡,光就會(huì)逐漸變?nèi)醪?
消失。實(shí)驗(yàn)中一定要使用適當(dāng)稀釋濃度的抗體,這樣才會(huì)在幾小時(shí)內(nèi)產(chǎn)生穩(wěn)定的光信號(hào)輸出,從而維持蛋白檢測(cè)的一致性和靈敏度。當(dāng)抗體沒(méi)被足
夠稀釋時(shí),永遠(yuǎn)不會(huì)獲得穩(wěn)定的光信號(hào)輸出。系統(tǒng)中太多的酶會(huì)快速氧化底物并終止信號(hào)。
化學(xué)發(fā)光,魯米諾在HRP和雙氧水存在的條件下會(huì)被氧化形成激發(fā)態(tài)的產(chǎn)物(3-aminophthalate)。3-aminophthalate在衰變至基態(tài)的過(guò)程中會(huì)
發(fā)出波長(zhǎng)為425nm的光。
femtoLUCENT? PLUS
化學(xué)發(fā)光的優(yōu)點(diǎn)
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靈敏性 |
?強(qiáng)信號(hào),低背景 ?只需很少的抗原和抗體 |
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快速 |
?印跡上快速的底物處理 ?信號(hào)在幾秒鐘之內(nèi)產(chǎn)生 |
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穩(wěn)定 |
?與放射性同位素不同,存放期很長(zhǎng) ?4oC儲(chǔ)存 |
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硬拷貝結(jié)果 |
?用X光膠片捕獲結(jié)果 ?結(jié)果不會(huì)隨時(shí)間而褪色,不用擔(dān)心膜的破裂 ?永久保存 |
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膠片結(jié)果 |
?信號(hào)隨曝光時(shí)間增強(qiáng)而增強(qiáng) ?可選擇在不同時(shí)間曝光 ?可優(yōu)化顯色的方法 |
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印跡可重新檢測(cè) |
?非同位素標(biāo)記的探針可從膜上洗掉 ?可重復(fù)進(jìn)行免疫檢測(cè) |
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寬線性范圍 |
?可檢測(cè)很寬范圍的蛋白濃度 |
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可定量 |
?可用反射型顯象密度計(jì)或成像設(shè)備 (例如CCD相機(jī))掃描X光膠片 |