二代測(cè)序近年來(lái)飛速發(fā)展，做過(guò)文庫(kù)構(gòu)建的小主們，是不是曾經(jīng)深受文庫(kù)產(chǎn)量低、質(zhì)量差、測(cè)序數(shù)據(jù)不好這些問(wèn)題的困擾？如何一步步排查問(wèn)題，找到癥結(jié)并優(yōu)化呢？

別著急，小編在這里為大家整理了NGS文庫(kù)構(gòu)建中的連接模塊正確測(cè)評(píng)方法及連接效率的影響因素，看完以后大家就對(duì)接頭連接有全局的把握，排除連接模塊對(duì)文庫(kù)的影響更是不在話下！

說(shuō)到接頭連接，就得從文庫(kù)制備的概念說(shuō)起了……

文庫(kù)制備（Library Preparation）就是在DNA片段兩端連上特定序列的接頭（兩側(cè)的序列不同）的過(guò)程。

在連接接頭過(guò)程中，不是所有的DNA片段都能兩端接上接頭，接頭連接效率的概念在這里就要引入了。接頭連接效率是指在DNA片段兩端均加上測(cè)序接頭的DNA量占起始總DNA量的比值。它是影響文庫(kù)產(chǎn)量的重要指標(biāo)之一，對(duì)文庫(kù)的質(zhì)量和產(chǎn)量具有重要的影響。若連接效率低，那么未連上接頭的DNA片段無(wú)法得到PCR擴(kuò)增；連接效率越高，代表文庫(kù)轉(zhuǎn)化率越高，可以說(shuō)，接頭連接效率直接影響最終的文庫(kù)復(fù)雜度和有效測(cè)序數(shù)據(jù)。

接頭連接效率這么重要，要如何對(duì)連接效率進(jìn)行正確的測(cè)評(píng)呢？

1.一般連接效率的評(píng)測(cè)方法

方法一：對(duì)比連接前后文庫(kù)的量。

指的是測(cè)定接頭連接前的文庫(kù)量，然后進(jìn)行接頭連接，純化后測(cè)定剩余的文庫(kù)量。這類(lèi)方法被很多人使用，實(shí)際上卻存在很大的問(wèn)題。通常連接后文庫(kù)中，會(huì)存在接頭、未連接接頭片段或者單端連接接頭的文庫(kù)，通過(guò)Qubit熒光定量，只能確定總的雙鏈DNA量，無(wú)法確定有效的雙端連接接頭文庫(kù)的量。因此此方法會(huì)與實(shí)際結(jié)果存在巨大誤差。并且磁珠的純化也有一定的文庫(kù)損失，具體效率無(wú)法準(zhǔn)確把控。

方法二：更換連接模塊做平行測(cè)試。

指的是通過(guò)更換不同的連接模塊，對(duì)比最終文庫(kù)產(chǎn)量，來(lái)評(píng)測(cè)不同連接模塊的連接效率高低。同樣，這類(lèi)方法也存在一些弊端，首先這種方法無(wú)法排除不同連接模塊與原體系的兼容性對(duì)產(chǎn)量的影響，其次這種方法只能間接的反映哪種連接模塊更有優(yōu)勢(shì)，無(wú)法評(píng)測(cè)具體連接模塊的連接效率。

總結(jié)：

以上兩種接頭連接的測(cè)評(píng)方法其實(shí)都犯了一類(lèi)錯(cuò)誤：將關(guān)注點(diǎn)放在文庫(kù)的產(chǎn)量上面而不是具體連接上接頭片段的比例。這是因?yàn)榻宇^的連接不僅要看接頭連接的文庫(kù)的產(chǎn)量，更要看連接文庫(kù)的效果，而后者才是評(píng)估連接效率的關(guān)鍵因素。

方法一：Agilent 2100檢測(cè)連接峰圖法

小編對(duì)此做了測(cè)試，對(duì)已知片段大小的DNA片段（350bp）進(jìn)行接頭連接，文庫(kù)在連接接頭后進(jìn)行Agilent 2100檢測(cè)，結(jié)果表明，雖然文庫(kù)連接上了接頭，但是只有兩端均連接上了接頭的文庫(kù)才能被擴(kuò)增和測(cè)序。當(dāng)未連接或單端連接接頭的含量很少時(shí)，或者雙端連接接頭的文庫(kù)含量高時(shí)，代表接頭連接的效率越高。

方法二：qPCR定量法

qPCR法定量文庫(kù)的方法是以qPCR為基礎(chǔ)，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線的校準(zhǔn)，精確定量文庫(kù)中用于雙端完整接頭的文庫(kù)數(shù)量。因?yàn)榇朔椒ㄊ褂玫囊餅橥ㄓ眯蛄?，若只有一端連接接頭或未連接接頭的文庫(kù)是無(wú)法得到擴(kuò)增，也就是無(wú)法檢測(cè)到熒光值，最終濃度是將這部分文庫(kù)排除。此方法可以精準(zhǔn)的測(cè)定文庫(kù)中成功連接接頭的文庫(kù)數(shù)量，以此可以精準(zhǔn)的評(píng)測(cè)連接的效率情況。

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